2.2.標準曲線和定量范圍（Calibration Curve）

標準曲線反映了所測定物質濃度與儀器響應值之間的關系，一般用回歸分析方法（如用加權最小二乘法）所得的回歸方程來評價。應提供標準曲線的線性方程和相關系數，說明其線性相關程度。標準曲線高低濃度范圍為定量范圍，在定量范圍內濃度測定結果應達到試驗要求的精密度和準確度。

配制標準樣品應使用與待測樣品相同生物介質，不同生物樣品應配制標準樣品制備各自的標準曲線，用于建立標準曲線的標準濃度個數取決于分析物可能的濃度范圍和分析物/響應值關系的性質。必須至少用6個濃度建立標準曲線，對于非線性相關可能需要更多濃度點。定量范圍要能覆蓋全部待測的生物樣品濃度范圍，不得用定量范圍外推的方法求算未知樣品的濃度。建立標準曲線時應隨行空白生物樣品，但計算時不包括該點，僅用于評價干擾。標準曲線各濃度點的實測值與標示值之間的偏差^* 在可接受的范圍之內時，可判定標準曲線合格。可接受范圍一般規(guī)定為最低濃度點的偏差在±20%以內，其余濃度點的偏差在±15%以內。只有合格的標準曲線才能對臨床待測樣品進行定量計算。當線性范圍較寬的時候，推薦采用加權的方法對

^*  ：偏差=[（實測值－標示值）/標示值]X100%標準曲線進行計算，以使低濃度點計算得比較準確。

2.3.定量下限（Lower Limit of quantitation，LLOQ）

定量下限是標準曲線上的最低濃度點，表示測定樣品中符合準確度和精密度要求的最低藥物濃度。LLOQ應能滿足測定3～5個消除半衰期時樣品中的藥物濃度或能檢測出Cmax的1／10～1／20時的藥物濃度。其準確度應在真實濃度的80%～120%范圍內，相對標準差(RSD)應小于20%。應由至少5個標準樣品測試結果證明。

2．4. 精密度與準確度(Prcision and Accuracy)

精密度是指在確定的分析條件下，相同介質中相同濃度樣品的一系列測量值的分散程度。通常用質控樣品的批內和批間RSD來考察方法的精確度。一般RSD應小于15％，在LLOQ附近RSD應小于20％。

準確度是指在確定的分析條件下，測得的生物樣品濃度與真實濃度的接近程度(即質控樣品的實測濃度與真實濃度的偏差)，重復測定已知濃度分析物樣品可獲得準確度。一般應85％～115％范圍內，在LLOQ附近應在80％～120％范圍內。

一般要求選擇高、中、低3個濃度的質控樣品同時進行方法的精密度和準確度考察。低濃度選擇在LLOQ的3倍以內，高濃度接近于標準曲線的上限，中間選一個濃度。在測定批內精密度時，每一濃度至少制備并測定5個樣品。為獲得批間精密度應至少在不同天連續(xù)制備并測定3個分析批(Analytical run/Analytical batch)，至少45個樣品。

2.5. 樣品穩(wěn)定性(Stability)

根據具體情況，對含藥生物樣品在室溫、冰凍和凍融條件下以及不同存放時間進行穩(wěn)定性考察，以確定生物樣品的存放條件和時間。還應注意考察儲備液的穩(wěn)定性以及樣品處理后的溶液中分析物的穩(wěn)定性，以保證檢測結果的準確性和重現性。

2.6.提取回收率

從生物樣本基質中回收得到分析物質的響應值除以純標準品產生的響應值即為分析物的提取回收率。也可以說是將供試生物樣品中分析物提取出來供分析的比例。應考察高、中、低3個濃度的提取回收率，其結果應當一致、精密和可重現。

2.7. 微生物學和免疫學方法確證

上述分析方法確證主要針對色譜法，很多參數和原則也適用于微生物學或免疫學分析，但在方法確證中應考慮到它們的一些特殊之處。微生物學或免疫學分析的標準曲線本質上是非線性的，所以應采用比化學分析更多的濃度點來建立標準曲線。結果的準確度是關鍵的因素，如果重復測定能夠改善準確度，則應在方法確證和未知樣品測定中采用同樣的步驟。

微生物學或免疫學分析方法確證實驗應包括在幾天內進行的6個分析批，每個分析批包括4個濃度（LLOQ，低、中、高濃度）的質控雙樣本。

3. 方法學質控

只有在生物樣本分析方法確證完成之后才能開始測定未知樣品。在測定生物樣品中的藥物濃度時應進行質量控制，以保證所建立的方法在實際應用中的可靠性。推薦由獨立的人員配制不同濃度的質控樣品對分析方法進行考核。（這樣保證實驗結果的準確性，也減少誤差）

每個未知樣品一般測定一次，必要時可進行復測。生物等效性試驗中，來自同一個體的生物樣品最好在同一批中測定。每個分析批生物樣品測定時應建立新的標準曲線，并隨行測定高、中、低三個濃度的質控樣品。每個濃度至少雙樣本，并應均勻分布在未知樣品測試順序中。當一個分析批中未知樣品數目較多時，應增加各濃度質控樣品數，使質控樣品數大于未知樣品總數的5%。質控樣品測定結果的偏差一般應小于15%，低濃度點偏差一般應小于20%，最多允許1/3不在同一濃度的質控樣品結果超限。如質控樣品測定結果不符合上述要求，則該分析批樣品測試結果作廢。

濃度高于定量上限的樣品，應采用相應的空白介質稀釋后重新測定。對于濃度低于定量下限的樣品，在進行藥代動力學分析時，在達到C_max以前取樣的樣品應以零值計算，在達到C_max以后取樣的樣品應以無法定量（Not detectable, ND）計算，以減小零值對AUC計算的影響。

4. 分析數據的紀錄與報告提交

在分析報告中，應提交完成這些實驗工作的相關資料。建立一般性和特殊性標準操作規(guī)程、保存完整的實驗記錄是分析方法有效性的基本要素。